Redaktita de Peter Sarnow, Universitato Stanforda Lernejo de Medicino, Universitato Stanford, Kalifornio, aprobita la 25-an de decembro 2020 (reviziita la 25-an de oktobro 2020)
Ni raportas la interagadon inter subunuoj en la reproduktado de koronavirus-transskribaj kompleksoj, kiuj estas esencaj por reproduktado kaj evolua konservado.Ni provizis indicon, ke la domajno NiRAN asociita kun nsp12 havas nukleozidan monofosfatan (NMP) transferaz-agadon en trans, kaj identigis nsp9 (RNA-liga proteino) kiel sia celo.NiRAN katalizas la kovalentan alligitecon de la NMP-duono al la konservita nsp9-aminofinstacio en reago kiu dependas de Mn2+-jonoj kaj apudaj konservitaj Asn-restaĵoj.Oni trovis, ke NiRAN-agado kaj nsp9 NMPylation estas esencaj por koronavirus-reproduktado.La datumoj permesas al ni ligi ĉi tiun agadon de la nestita virusa enzimsigno al la antaŭaj observoj en la hipotezo, ke la komenco de RNA-sintezo en klaso de RNA-virusoj estas funkcie kaj evolue konsekvenca.
La RNA-dependa RNA polimerazo (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, kaj 12 aliaj familioj) estas ligita al la amino-fina (N-fina) domajno en la ne-struktura proteino (nsp) liberigita de la poliproteino, nomita NiRAN. 1ab estas kunmetita de virusa ĉefa proteazo (Mpro).Antaŭe, la propra GMPylation/UMPylation-agado de la arteria viruso NiRAN-RdRp nsp estis raportita, kaj estis sugestite generi paseman por la translokigo de nukleozidmonofosfato (NMP) al la (nuntempe nekonata) viruso kaj/aŭ ĉelbiopolimerigo Aĵoj.Ĉi tie, ni montras, ke la koronavirus (Homa Koronavirus [HCoV]-229E kaj Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) havas Mn2+-dependan NMPylation-agadon, kiu estas derivita de nsp9 per la formado de Mpro-mediaciita nsp9 Post la N-finaĵo laŭflankanta nsps estas proteolitike liberigita, la fosforamidato estas ligita al la primara amino (N3825) ĉe la N-finaĵo de nsp9.Uridintrifosfato estas la preferata nukleotido en tiu reago, sed adenozintrifosfato, guanozintrifosfato, kaj citidintrifosfato ankaŭ estas taŭgaj kunsubstratoj.Mutaciostudoj uzantaj rekombinajn koronavirusajn proteinojn nsp9 kaj nsp12 kaj genetike faritajn mutaciulojn HCoV-229E determinis la restaĵojn necesajn por NiRAN-mediaciita nsp9 NMPylation kaj virusreproduktado en ĉelkulturo.La datumoj konfirmis la antaŭdiron de NiRAN-aktivaj restaĵoj kaj determinis la gravan rolon de nsp9 N3826-restaĵoj en nsp9 NMPylation kaj virusreproduktado en vitro.Ĉi tiu restaĵo estas parto de la konservita N-fina NNE-tripeptidsekvenco kaj pruvis esti la nura senvaria restaĵo de nsp9 kaj ĝiaj homologoj en la koronavirus-familio.Ĉi tiu studo disponigas solidan fundamenton por la funkcia studo de NMPylation-agado de aliaj nestitaj virusoj kaj proponas eblajn celojn por la evoluo de kontraŭvirusaj medikamentoj.
Nidovirales pozitiv-senhelpa RNA-viruso infektas diversajn vertebrulojn kaj senvertebrulojn (1, 2).La ordo nuntempe inkluzivas 14 familiojn (3), el kiuj la Koronavirus-familio estis vaste studita en la lastaj 20 jaroj.En tiu tempo, tri zoonozaj koronavirusoj eliris el bestaj gastigantoj kaj kaŭzis grandskalajn eksplodojn de severaj spiraj infektoj en homoj.Inkluzive de konstantaj pandemioj kaŭzitaj de severaj akraj infektaj malsanoj.Spira Sindromo Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusoj dividas oftan genarorganizon, kaj la subunuo de la membran-ligita reproduktad-transskriba komplekso (RTC) estas ĉifrita en la 5-?²-finaj du trionoj kaj la ĉefa struktura subunuo de la viruspartiklo, same kiel kelkaj akcesoraĵoj. .Proteino, kodita en la 3??² fina triono de la genaro (1).Krom unu familio de planariaj virusoj (Monoviridae) (8), ĉiuj nestitaj virusoj ĉifras RTC-subunuojn en du grandaj malfermaj legokadroj (ORF) ORF1a kaj ORF1b, kiuj estas tradukitaj de genoma RNA de.ORF1a ĉifras poliproteinon (pp) 1a, kaj ORF1a kaj ORF1b komune ĉifras pp1ab.Kun la ĝenerala partopreno de la ĉefproteazo (Mpro) ĉifrita fare de ORF1a, kaj pp1a kaj pp1ab estas proteolitike prilaboritaj en gamon da ne-strukturaj proteinoj (nsps), ankaŭ konataj kiel 3CLpro, ĉar ĝi havas homologion kun la 3Cpro de la picornavirus ( 9).Tiuj nsps supozeble estas kunvenitaj en grandan dinamikan RTC, katalizas la sintezon de genomic RNA (reproduktado) kaj aron de subgenomic RNA (transskribo), kaj kutimas kunordigi la esprimon de la ORF situanta laŭflue de ORF1b (10?? ?12).
La kerno RTC inkluzivas RNA-dependan RNA polimerazon (RdRp) (13), superfamilion 1 helicazo (HEL1) (14, 15) kaj plurajn RNA-pretigenzimojn, kiuj estas ĉefe ĉifritaj en ORF1b kaj en la koronavirus-familio Ĝi enhavas nsp12-nsp16 kaj nsp9-nsp12 en la familio de Arterioviridae (vidu referencon 10ââ 12).RdRp kaj HEL1 reprezentas du (unu kvinonon) konservitajn domajnojn de la birdnestoviruso kaj havas homologion inter aliaj RNA-virusoj.Kernreplikazo verŝajne estas helpita per aliaj subunuoj, inkluzive de pluraj malgrandaj nsps liberigitaj de la karboksi-fina (C-fina) regiono de pp1a, laŭflue de Mpro ( koronavirus nsp5 kaj arteria viruso nsp4, respektive).Ili havas limigitan familiospecifan protekton kaj diversajn agadojn (reviziitajn en referenco 10ââ12).
Relative lastatempe, domajno kun unikaj sekvencaj ĉeftrajtoj estis trovita ĉe la aminofinaĵo (N-finstacio) najbara al RdRp en ĉiuj nestitaj virusoj, sed neniuj aliaj RNA-virusoj (16).Surbaze de ĝia loko kaj nukleotidtransferazo (nukleozidmonofosfato [NMP] transferazo) agado, tiu domajno estas nomita NiRAN (Nestvirus RdRp-rilata nukleotidtransferazo).La duobla-domajna kombinaĵo de NiRAN-RdRp konsistigas nsp12 en la Coronaviridae-familio kaj nsp9 en la Arterioviridae-familio, kaj en aliaj nestoviridae, NiRAN-RdRp estas atendita esti liberigita kiel sendependa nsp de la viruspoliproteino.En la koronavirus, la NiRAN-domajno enhavas ??1/450 restaĵojn kaj estas konektita al la C-fina RdRp-domajno tra la ligilregiono (16-19).En Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombina nsp9 montras Mn2+-jon-dependajn (mem) UMPylation kaj GMPylation-agadojn, kiuj dependas de tri konservitaj sekvencobazoj en nestoviruso, AN, BN kaj CN La restaĵoj en la sekvenco.Kie N signifas NiRAN) (16).La N-fina flankado de tiuj ĉeftemoj estas malpli konservativa ĉeftemo preAN.Kelkaj el tiuj restaĵoj ankaŭ estas konservitaj en malproksime rilataj proteinkinazoj, kie ili pruviĝis esti implikitaj en nukleozida trifosfato (NTP) ligado kaj kataliza agado (20, 21).Konsekvence kun ĉi tiu observado, pluraj ŝlosilaj aktivaj restaĵoj en la pseŭdokinazo SelO de Pseudomonas syringae povas esti kunvenitaj kun la lastatempe publikigita SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkomplekso.Konservitaj Coronavirus NiRAN-restaĵoj supermetitaj en la elektrona mikrostrukturo.Rekombina proteino (17).Estas konjektita ke la dokumentita (mem) U/GMPylation produktos paseman staton por transdoni NMP al la (nuntempe nekonata) substrato (16), kaj la struktura simileco inter NiRAN kaj proteinkinazo (17, 19) ) Estas la hipotezo ke NiRAN modifas aliajn proteinojn.
Multaj ecoj, inkluzive de ĝia unika kaj unika sistema asocio kun nestitaj virusoj kaj genetika apartigo de RdRp, igas NiRAN akceptebla ŝlosila reguliga enzimo por nestitaj virusoj, kio estas kritika al ilia apero kaj identeco.Antaŭe, tri eblaj funkcioj implikantaj NiRAN por reguligi genaron/subgenomian tradukon aŭ reproduktadon/transskribon estis nomitaj.Konsiderante la malabundajn kaj nekompletajn datumojn disponeblajn tiutempe, ĉiu funkcio havas siajn avantaĝojn kaj malavantaĝojn (16).En ĉi tiu esplorado, ni celas kombini la biokemiajn kaj inversajn genetikajn studojn de la koronavirusoj reprezentantaj la du genrojn, kaj meti niajn trovojn en la evoluan fonon de la natura mutacio de la koronavirus-familio, por akiri sciojn pri ĉi tiu Mistera regno.Ni raportas gravajn progresojn en la kompreno de NiRAN per la identigo de naturaj celoj en RTC, kiu (inter la tri disponeblaj hipotezoj) kontribuas al la rolo de ĉi tiu domajno en iniciatado de la sintezo de nestita virusa RNA.Ĉi tiu esplorado ankaŭ malfermas eblecojn por aliaj roloj de NiRAN sur la virusa gastiga interfaco.
Por karakterizi la enzimecojn de la koronavirus-nsp12-rilata NiRAN-domajno, ni produktis rekombinan formon de homa koronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 en E. coli, kun His6-etikedo ĉe la C-finaĵo, kaj kombinis la proteino kun [α32-P] Inkubi kune kun NTP en la ĉeesto de MnCl2 kiel priskribite en Materialoj kaj Metodoj.La analizo de la reagprodukto indikis la ĉeeston de radiomarkita proteino kunmigranta kun nsp12 (106 kDa), indikante, ke koronavirus nsp12 katalizas la formadon de kovalentaj protein-NMP-aduktoj, prefere formitaj kun uridinmonofosfato (UMP) (Figuro 1A) Kaj B).Kvanta analizo montris, ke kompare kun aliaj nukleotidoj, la signala intenseco de UMP-aliĝo pliiĝis je 2 ĝis 3 fojojn (Figuro 1C).Ĉi tiuj datumoj kongruas kun la antaŭdirita NMP-transferaza agado de la domajno NiRAN de la koronavirus (16), sed indikas, ke la nukleotidaj preferoj de la domajno NiRAN de la koronavirus kaj la arteria viruso estas malsamaj.
Mem-NMPylation-agado de HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) estis kovita kun la nomumita [α-32P] NTP en ĉeesto de 6 mM MnCl2 dum 30 minutoj (vidu Materialojn kaj Metodojn por detaloj).La reagproduktoj estis apartigitaj per SDS-PAGE kaj makulitaj per Coomassie brila bluo.(B) La radiomarkita proteino estas bildigita per fosforbildigo.La pozicioj de nsp12-His6 kaj proteinaj molekulaj massignoj (en kilodaltonoj) estas montritaj en A kaj B. (C) La intenseco de la radioaktiva signalo (meznombro ± SEM) estis determinita de tri sendependaj eksperimentoj.*P≤0.05.La signalforto (procento) rilatas al UTP.
Kvankam NiRAN-rilataj enzimaj agadoj pruviĝis esencaj por la reproduktado de EAV kaj SARS-CoV en ĉelkulturo (16), la specifa NiRAN-funkcio kaj eblaj celoj ankoraŭ ne estis determinitaj.La lastatempe raportita struktura simileco inter NiRAN kaj familio de proteinoj kun proteinkinaz-similaj faldoj (17, 22) instigis nin testi la hipotezon ke NiRAN katalizas la NMPylation de aliaj proteinoj.Ni generis aron de eblaj homologaj celoj, inkluzive de ne-strukturaj proteinoj koditaj de HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ĉiu enhavante C-finan etikedon His6 (SI-apendico, Tabelo S1), Kaj kovu tiujn proteinojn kun [α32-P] uridintrifosfato ([α32-P]UTP) en la ĉeesto aŭ foresto de nsp12.Bova serumalbumino kaj MBP-LacZα fuzia proteino produktita en E. coli servis kiel kontroloj (Figuro 2A, lenoj 1 ĝis 7).La radioetikedita proteino estis analizita per natria dodecilsulfato-poliakrilamida ĝela elektroforezo (SDS-PAGE) kaj aŭtoradiografio, kaj estis trovita ke ekzistis forta radioaktiva signalo en la reago enhavanta nsp12 kaj nsp9.La pozicio de la signalo respondas al la molekula maso de nsp9, indikante nsp12-mediatan UMPylation de nsp9 (Figuro 2B, trako 7).Neniuj aliaj testproteinoj estis trovitaj esti UMPilitaj, kio igis nin konkludi ke nsp9 estas specifa substrato de nsp12.Konsekvence kun la mem-NMPylation-datenoj montritaj en Figuro 1, nsp12 povas transdoni ĉiujn kvar NMPojn al nsp9, kvankam la efikeco estas malsama, UMP> adenozinmonofosfato (AMP)> guanozinmonofosfato (GMP)> citidinmonofosfato (CMP) ) ( Bildo).3 A kaj B).Sub la kondiĉoj uzataj en ĉi tiu provo (mallongigi la reagon kaj ekspontempon, redukti la koncentriĝon de nsp12; materialoj kaj metodoj), la mem-NMPylation de nsp12 ne povus esti detektita (komparu Figuron 2B, lenon 7, kaj Figuro 1B), kiu pruvis efika (Kaj multoblaj raŭndoj) UMP moviĝis de nsp12 al nsp9.UMP-transferaza agado postulas la ĉeeston de Mn2+-jonoj, kiel montrite en Figuro 3C, dum nur minimuma UMP-transferaza agado estis observita en la ĉeesto de Mg2+, kaj neniu agado en la ĉeesto de la aliaj du divalentaj katjonoj testitaj.Similaj datumoj estis akiritaj en NMPylation-testoj enhavantaj citidintrifosfaton (CTP), guanozintrifosfaton (GTP), kaj adenozintrifosfaton (ATP) (SI-apendico, Figuro S1).
HCoV-229E nsp12-mediata UMPylation de nsp9.Serio de proteinsubstratoj (inkluzive de bova serumalbumino, MBP-lacZα, kaj serio de HCoV-229E nsps etikeditaj kun C-fina His6 ĉifrita fare de ORF1a) estis uzitaj por taksi la UMPylation-agadon de HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediaciita. proteino.Kovu la proteinon kun [α-32P] UTP dum 10 minutoj en foresto (A) aŭ ĉeesto (B) de nsp12 kiel priskribite en la materialoj kaj metodoj.Ĉe la supro de A kaj B, SDS-poliakrilamida ĝelo makulita kun Coomassie Brilliant Blue estas montrita, kaj ĉe la fundo de A kaj B, la ekvivalentaj aŭtoradiogramoj estas montritaj.La pozicio de la proteina molekula massigno (en kilodaltonoj) estas donita maldekstre.La pozicio de nsp12-His6 (B, supro) kaj la radioaktiva signalo observita dum la kovado de nsp12-His6 kun nsp9-His6 (B, leno 7) ankaŭ estas indikitaj, kio indikas ke [α-32P]UMP al nsp9-His6 (12.9 kDa), kiu ne estis observita por aliaj proteinoj testitaj.
HCoV-229E NiRAN-mediaciita biokemia kaj virologia karakterizado de nsp9 NMPylation.(A kaj B) La rolo de la nukleotida kunsubstrato uzita en la reago.Nsp12-His6 kaj nsp9-His6 estas miksitaj kaj kovataj en la ĉeesto de malsamaj [α-32P] NTPoj en la norma NMPylation-analizo.(A, supro) Coomassie-makulita nsp9-His6 apartigita per SDS-PAĜO.(A, malsupre) Aŭtorradiografo de la sama areo de la ĝelo.(B) La relativa agado (mezumo ± SEM) en la ĉeesto de la elektita nukleotida kofaktoro estas determinita de tri sendependaj eksperimentoj.*P≤0.05.(C) La rolo de metalaj jonoj.Montrita estas la norma NMPylation-testo en la ĉeesto de [α-32P] UTP kaj malsamaj metaljonoj, ĉiu kun koncentriĝo de 1 mM.En C, la supro, Coomassie makulita nsp9-His6 estas montrita, kaj en C, la fundo, la ekvivalenta aŭtoradiografio estas montrita.La grandeco de la etikedita proteino (en kilodaltonoj) estas montrita maldekstre de A kaj C. (D) La mutaciulformo de HCoV-229E nsp12-His6 portanta la precizigitan aminoacidan anstataŭigon estas en [α-32P]UTP, kiel priskribite. en Materialoj kaj Metodoj.La radiomarkita nsp9-His6 produktita en la NMPylation-reago estas detektita per fosforiligobildigo (D, supro).La relativa agado kompare kun la sovaĝ-speca (wt) proteino estas montrita en D, kaj la fundo estas prenita kiel la mezumo (± SEM) de tri Sendependa eksperimento.Asteriskoj indikas anstataŭaĵojn de ne-konservitaj restaĵoj.(E) La virustitolo en la kultura supernatant de p1-ĉeloj akiritaj 24 horojn post infekto estis determinita per plaka analizo.La kodonanstataŭaĵoj en la NiRAN-domajno de la realigita HCoV-229E-mutaciulo estas indikitaj (restnumerado estas bazita sur ilia pozicio en pp1ab).La reprodukt-manka RdRp aktiva eja mutaciulo nsp12_DD4823/4AA estis utiligita kiel kontrolo.
Por akiri pli profundan komprenon pri la aktiva loko de NiRAN kaj determini la restaĵojn ligitajn al la agado de nsp9-specifa NMP-transferazo, ni faris mutacian analizon, en kiu ni anstataŭigis la konservativaj restaĵoj en la motivoj NiRAN AN, BN kaj CN ( 16) Ĝi estas Ala (SI-apendico, Figuro S2).Krome, la efiko de konservativaj Arg-al-Lys aŭ Lys-al-Arg anstataŭoj estis taksita en du kazoj.Kiel (negativa) kontrolo, restaĵoj kiuj estas ne aŭ malpli konservitaj en la NiRAN-domajno de koronavirusoj kaj aliaj nestitaj virusoj estas anstataŭigitaj per Ala. Anstataŭigante K4116A (en motivo preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivo). BN) kaj D4280A (CN) signife reduktas aŭ eĉ forigas nsp9 NMPylation tra nsp12, dum proteinoj kun konservativaj anstataŭaĵoj (R4178K), K4116R) retenas 60% kaj 80% de sia aktiveco, kio indikas, ke la malstreĉiĝo de la limigoj sur sia respektiva flanko. ĉenoj estas fizikokemie sentemaj (Figuro 3D).Anstataŭigi plurajn aliajn konservitajn restaĵojn E4145A, D4273A, F4281A kaj D4283A estas multe malpli damaĝa, kaj nsp9 UMPylation estas nur modere reduktita.Similaj rezultoj estis akiritaj en nsp9-NMPylation-reagoj implikantaj aliajn NTP-ojn (Figuro 3D kaj SI-apendico, Figuro S3), konfirmante, ke la observitaj efikoj al specifaj aminoacido-anstataŭiĝoj estas sendependaj de la speco de nukleotida kunsubstrato uzata.Poste, ni testis la eblan efikon de ĉi tiuj anstataŭigoj de nsp12 sur la reproduktado de koronavirusoj en ĉelkulturo.Tiucele, ni uzis taŭgajn genetike realigitajn komplementajn DNA (cDNA) ŝablonojn klonitajn en rekombina vaccinia viruso (23, 24) por transskribi 5-7 ĉelojn.Titrado de infekta virusdeveno produktita en ĉi tiuj ĉeloj montris ke la plej multaj HCoV-229E NiRAN-mutaciuloj ne estis realigeblaj (Figuro 3E).Grupo de ne-realigeblaj virusmutaciuloj inkludas alternativojn kiuj pruviĝis elimini aŭ signife redukti NMP-transferazaktivecon en vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), sed ekzistas du aliaj alternativoj (K4116R, E41045A) % rezervita?Ilia en vitro NMPylation-agado indikas ke kromaj restriktoj estas implikitaj.Simile, du aliaj mutacioj (R4178K, F4281A) kiuj kaŭzis moderan malkreskon en la envitra NMPylation-agado de NiRAN produktis vivajn virusojn, aliflanke, tiuj virusoj signife reduktis titolojn tra reproduktado.Konsekvence kun la in vitro-agado-datenoj montritaj en Figuro 3D, anstataŭigante kvar aliajn restaĵojn kiuj ne estas konservitaj en koronavirus kaj/aŭ aliaj nestitaj virusoj (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produktis realigeblajn virusojn La idoj, malgraŭ havi modere reduktita titolo kompare al la sovaĝa-tipa viruso (Figuro 3E).
Por studi ĉu NiRAN-mediaciita NMP-transferazo-agado dependas de la aktiva RdRp-domajno, la du konservitaj Asp-restaĵoj implikitaj en la kunordigo de divalentaj metalaj jonoj (11) en RdRp-ĉeftemo C estis anstataŭigitaj per Ala. La rezulta proteino nsp12_DD4823/4AA retenas ĝia nsp9-NMPylation-agado, indikante, ke nsp12-mediata en vitro-nsp9-NMPylation-agado ne postulas polimerazan agadon (SI-Apendico, Figuro S4).
Post establi la nsp9-specifan NMP-transferazan agadon por nsp12, ni provis karakterizi la NMP-nsp9-adukton per mas-spektrometrio (MS).La kompleta proteina masspektro de rekombina HCoV-229E nsp9 montris pinton ĉe 12,045 Da (Figuro 4A).La aldono de nsp12 ne ŝanĝis la kvaliton de nsp9, indikante, ke nsp12 kaj nsp9 ne formus stabilan komplekson sub la uzitaj kondiĉoj (malnaturado) (Figuro 4A).En la ĉeesto de UTP kaj GTP, la amasmezurado de la reago enhavanta nsp9 kaj nsp12 respektive montris ke la proteinmaso de UTP movis 306 Da, kaj la proteinmaso de GTP movis 345 Da, indikante ke ĉiu nsp9-molekulo ligas UMP aŭ GMP. (Bildo 4) C kaj D).Estas konjektite ke la energio postulata por NiRAN-mediaciita nsp9 NMPylation venas de NTP-hidrolizo kaj pirofosfatliberigo.Kvankam 10-obla mola troo de nsp9 (celo) ol nsp12 (enzimo) estis uzita en ĉi tiu reago, preskaŭ kompleta NMPylation de nsp9 estis observita, indikante ke la interagado inter nsp12 kaj nsp9 estas mallongdaŭra, kaj nsp12 povas NMPylate pli nsp9. in vitro molekulo.
Ununura NMPylation de nsp9 en la ĉeesto de nsp12 kaj UTP aŭ GTP.Montrita estas la malkonvoluta kompleta proteina masspektro de HCoV-229E nsp9 (SI-apendico, Tabelo S1) (AD).(A) nsp9 sole, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 en la ĉeesto de UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 en la ĉeesto de GTP.
Por determini la nsp9-restaĵojn UMPiligitajn de nsp12, nsp9-UMP estis fendita kun tripsino.La rezultaj peptidoj estis apartigitaj per nano-alta rendimento likva kromatografio (HPLC) kaj analizitaj per tandema mas-spektrometrio (MS/MS) rete.Datenanalizo uzante la Byonic-programarpakaĵon (Protein Metrics) montris UMPylation de la N-fina aminoacido.Ĉi tio estas konfirmita permane.La tandema masspektro de la antaŭulo peptido [UMP] NNEIMPGK (SI-apendico, Figuro S5A) rivelis fragmenton je 421 m/z, indikante ke UMP ligas al restaĵo 1 de nsp9.
Ĉe la N-finaĵo de nsp9, Asn estas konservita inter la membroj de Orthocoronavirinae (SI-apendico, Figuro S6).Kvankam ni kredas, ke la N-fina primara amina nitrogeno estas la plej verŝajna akceptanto por UMP, ni decidis akiri pliajn pruvojn pri NMP-ligado ĉe la N-finaĵo.Tial, la ne-NMPilated kaj NMPylated N-fina peptido nsp9 purigita per HPLC estis derivita en la ĉeesto de acetono kaj natria cianoborohidrido.Sub ĉi tiuj kondiĉoj, nur liberaj primaraj aminoj povas esti modifitaj kun propilo (25).La N-fina nsp9-derivita peptido kun la sekvenco NNEIMPGK enhavas du primarajn aminojn, unu ĉe la N-finstacio de Asn kaj la aliaj ĉe la flankĉeno de Lys ĉe la C-finstacio.Tial, propilgrupoj povas esti lanĉitaj ĉe ambaŭ finoj.La ĉerpitaj jonaj kromatogramoj de ne-NMPiligitaj peptidoj estas montritaj en la SI-apendico, Figuro S5B.Kiel atendite, N-finaj kaj C-finaj (mono)propilitaj (SI-apendico, Figuro S5B, supra leno) kaj dipropilitaj peptidoj (SI-apendico, Figuro S5B, malsupra leno) povas esti identigitaj.Ĉi tiu ŝablono ŝanĝiĝas kun la uzo de la NMPylated N-fina peptido de nsp9.En ĉi tiu kazo, nur C-finaj propilitaj peptidoj povas esti identigitaj, sed N-finaj propilitaj peptidoj kaj dipropilitaj peptidoj ne estas identigitaj (SI-Apendico, Figuro S5C), indikante ke UMP estis transdonita al la N-fina primara amino Por malhelpi tion. grupo de fari ŝanĝojn.
Poste, ni anstataŭigas (kun Ala aŭ Ser) aŭ forigas la konservitajn restaĵojn ĉe la N-finaĵo de nsp9 por difini celspecifajn limojn.Surbaze de niaj MS-datenoj montrantaj, ke NiRAN formas nsp9-NMP-adukton kun la primara amino de la N-fina restaĵo de nsp9, ni hipotezis, ke nsp9 NMPylation postulas, ke la virus-majstra proteazo (Mpro, nsp5) liberigu la nsp9 N-finaĵon de. ĝia poliproteina antaŭulo.Por testi ĉi tiun hipotezon, ni produktis antaŭan proteinon nsp7-11 enhavantan nsp9 en E. coli kaj faris norman NMPylation-teston en ĉeesto de [α-32P] UTP (materialoj kaj metodoj).Kiel montrite en Figuro 5A (leno 3), la netranĉita nsp7-11-antaŭulo ne estas radioetikedita kun nsp12.En kontrasto, se nsp7-11 estas fendita per rekombina nsp5 por liberigi nsp9 (kaj aliajn nsps) de la antaŭulo, radioetikedita proteino kiu migras kun nsp9 estas detektita, konfirmante nian konkludon ke NiRAN kaj N-Selektema formado de kovalentaj nsp9-NMP-aduktoj. .La fina primara amino de la N-fina Asn (pozicio 3825 en pp1a/pp1ab).Ĉi tiu konkludo ankaŭ estas subtenata de eksperimentoj uzantaj la nsp9-konstruaĵon, kiu enhavas unu aŭ du kromajn restaĵojn ĉe la N-finaĵo.En ambaŭ kazoj, NiRAN-mediaciita UMPylation de nsp9 estis aboliciita (SI-Apendico, Figuro S7).Poste, ni produktis proteinon kun unu aŭ du Asn-restaĵoj forigitaj de la peptida sekvenco 3825-NNEIMPK-3832 ĉe la N-finaĵo de nsp9.En ambaŭ kazoj, nsp9 UMPylation estis tute blokita (Figuro 5B), provizante kroman indicon ke la reala nsp9 N-finstacio funkcias kiel NMP-receptoro.
La proteoliza pretigo de nsp9 kaj la rolo de N-finaj restaĵoj en nsp12-mediaciita UMPylation.(A) nsp9 UMPylation postulas liberan nsp9 N-finaĵon.Nsp7-11-His6 estas antaŭ-inkubita je 30 °C en NMPylation-detektobufro enhavanta UTP en la ĉeesto aŭ foresto de rekombina Mpro (nsp5-His6).Post 3 horoj, komencu la provon de NMPylation aldonante nsp12-His6 kiel priskribite en Materialoj kaj Metodoj.La reago enhavanta nsp5-His6 (leno 1) kaj nsp9-His6 (leno 2) estis utiligita kiel kontrolo.Post 10 minutoj, la reago estis ĉesigita kaj la reakcia miksaĵo estis apartigita per SDS-PAGE.La proteino estis makulita per Coomassie Brilliant Blue (A, supro).La Nsp7-11-His6-antaŭulo kaj la prilaborita produkto rezultiĝanta el nsp5-His6 mediaciita fendetaĵo estas montritaj dekstre.Bonvolu noti (pro ilia malgranda grandeco) ke nsp7 kaj nsp11-His6 ne estas konstateblaj en ĉi tiu ĝelo, kaj la reago estas kompletigita kun nsp5-His6 (lenoj 1 kaj 4; la pozicio de nsp5-His6 estas indikita per solida cirklo) aŭ nsp9-His6 (Leno 2) enhavas malgrandan kvanton de MBP (indikita de malfermaj cirkloj) kiel restaj malpuraĵoj ĉar ili estas esprimitaj kiel MBP-fuzioproteinoj (SI-apendico, Tabelo S1).(B) Al la varianto Nsp9-His6 mankas unu aŭ du N-finaj Asn-restaĵoj (restaĵnumero laŭ la pozicio en pp1a/pp1ab) kaj estas purigita kaj kovita kun nsp12-His6 kaj [α-32P] UTP.B, SDS-PAĜO makulita per Coomassie estas montrita supre, B, la responda aŭtoradiografo estas montrita malsupre.La pozicio de la molekula pezosigno (en kilodaltonoj) estas montrita maldekstre.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-finaj konservitaj restaĵoj estis anstataŭigitaj per Ala aŭ Ser, kaj la sama kvanto da proteino estis uzita en la nsp12-His6 mediaciita UMPylation-reago.La reagproduktoj estis apartigitaj per SDS-PAGE kaj makulitaj per Coomassie Brilliant Blue (C, supro), kaj radioetikedita nsp9-His6 estis detektita per fosforeska bildigo (C, mezo).Uzante sovaĝ-specan (wt) proteinon kiel referencon (agordita al 100%), la relativa NMPylation-agado (meznombro ± SEM) estis kalkulita el tri sendependaj eksperimentoj.(D) Virustitoloj en la p1 ĉelkultursupernatant de Huh-7-ĉeloj infektitaj kun HCoV-229E sovaĝ-tipaj Huh-7-ĉeloj, kaj mutaciuloj portantaj elektitajn aminoacidajn anstataŭaĵojn en nsp9 estis determinitaj per plaka analizo.La reprodukt-manka RdRp ĉeftemo C duobla mutaciulo DD4823/4AA estis utiligita kiel negativa kontrolo.
La N-finaĵo de nsp9 (precipe pozicioj 1, 2, 3, kaj 6) estas tre konservita inter membroj de la subfamilio de Orthocoronavirinae (SI-apendico, Figuro S6).Por studi la eblan rolon de ĉi tiuj restaĵoj en nsp12-mediaciita nsp9 NMPylation, du sinsekvaj Asn-restaĵoj ĉe la N-finaĵo de nsp9 estis anstataŭigitaj kun Ala aŭ Ser (sole aŭ en kombinaĵo).Kompare kun sovaĝa tipo nsp9, anstataŭigi N3825 kun Ala aŭ Ser rezultigis pli ol duoblan redukton en nsp12-mediaciita UMPylation (Figuro 5C).Konsekvence kun nia konkludo, ke NMPylation okazas ĉe la N-fina primara amino anstataŭ la flanka ĉeno de la N-fina restaĵo, ni observis signifan restan NMPylation kun la anstataŭigo de N3825A kaj N3825S.Kurioze, se la dua Asn estas anstataŭigita per Ala aŭ Ser, nsp9 UMPylation estas reduktita pli forte (pli ol 10 fojojn), dum la anstataŭigo de Ala ĉe pozicioj 3, 4, kaj 6 havas nur moderan efikon sur nsp9 UMPylation (Figuro 2). ).5C).Similaj rezultoj estis akiritaj uzante ATP, CTP aŭ GTP (SI-apendico, Figuro S8).Kolektive, ĉi tiuj datumoj indikas la ŝlosilan rolon de N2826 (pozicio 2 en nsp9) en nsp9 NMPylation.
Por akiri pliajn pruvojn pri la funkcia korelacio inter la N-finaĵo de nsp9 kaj NMPylation, ni faris multoblan sinsekvan vicigon (MSA) de la nsp9-sekvenco de la Koronavirus-familio (varianta inter 104 kaj 113 restaĵoj) (SI-Apendico, Figuro). S6).En totalo, en 47 (konataj kaj supozataj) specioj de 5 genroj de la Orthocoronavirinae subfamilio kiuj infektas malsamajn mamulojn, birdojn, kaj reptiliajn gastigantojn, nur 8 restaĵoj entute estis trovitaj esti senvariaj.La plej ampleksaj ŝanĝoj, inkluzive de forigoj kaj enmetoj, estis observitaj en la cikloj inter la sekundaraj strukturelementoj de nsp9, kiel determinite de antaŭaj strukturaj studoj (26 ??28).Kvin senvariaj restaĵoj estis trovitaj en la β-fadeno kaj α-helico de la C-fina parto de nsp9.Tri senvariaj restaĵoj konsistigas la NNE-ĉeftemon de la N-finstacio de nsp9.Estas rivelita ke la dua Asn de tiu ĉeftemo estas la nura senvaria restaĵo, kiu ankaŭ estas dividita per la hipoteza nsp9 de la malproksime rilata rankoronviruso, kaj reprezentas la Microhyla letovirus 1 specion en la subfamilio Letovirinae de Alphaletovirus.La konservado de restaĵoj en nsp9 sekundaraj strukturelementoj povas esti raciigita per strukturaj konsideroj por konservi faldeblajn aŭ konatajn RNA-ligajn trajtojn.Tamen, ĉi tiu rezonado ne ŝajnas apliki al la konservado de NNE, kaj antaŭ ĉi tiu studo, la naturo de la limoj, kiuj limigas la varion de la tripeptida sekvenco, estis tute obskurita.
Por determini la gravecon de nsp9-NMPylation kaj NNE-konservado en koronavirus-reproduktado, ni produktis HCoV-229E-mutaciulojn, kiuj portas ununurajn aŭ duoblajn anstataŭaĵojn de nsp9-N-finaj restaĵoj, indikante, ke nsp9-NMPylation estas malutila en vitro.Antaŭ ol komenci, ni provas respondi la demandon, ĉu ĉi tiuj anstataŭoj (proksime de la fendiloko nsp8|9) influas la proteolizan prilaboradon de la C-fina regiono pp1a.Aro de nsp7-11-poliproteinkonstruaĵoj enhavantaj ekvivalentajn anstataŭaĵojn ĉe la N-finstacio de nsp9 estis produktita en E. coli kaj tranĉita kun rekombina Mpro.La proteoliza fendetaĵo de la kvar ejoj (inkluzive de la nsp9 laŭflankanta ejon) ne estas signife trafita per iuj enkondukitaj anstataŭoj (SI-apendico, Figuro S9), ekskludante strukturajn ŝanĝojn en tiuj proteinoj kiuj malhelpas Mpro-mediaciitan nsp8|9-interfendo (Aŭ aliaj) retejo.
Huh-7-ĉeloj estis transfektitaj kun genom-longa HCoV-229E RNA, kodante Ala aŭ Ser-anstataŭiĝojn en la konservitaj NNE-tripeptidoj (N3825, N3826, kaj E3827) ĉe la nsp9 N-finstacio, montrante ke la plej multaj el la mutacioj estas mortigaj.Ni povis savi la viruson anstataŭigante la Ser aŭ Ala de la N-fina Asn (N2835A aŭ N2835S), sed ne sukcesis reakiri la viruson kun aliaj unuopaj kaj duoblaj mutacioj en la NNE-sekvenco (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Figuro 5D).
Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke la reproduktado de koronavirusoj en histokulturo estas limigita (sama aŭ simila), limigante la naturan mutacion de nsp9 NMPylation-ejoj en la korpo, kaj subtenante la ŝlosilan rolon de ĉi tiu respondo en la vivociklo de koronavirusoj.
En la lasta aro de eksperimentoj, ni produktis C-finan His6 etikeditan SARS-CoV-2 nsp12 kaj nsp9, kaj du mutaciajn formojn de nsp12 en E. coli.La aktivaj restaĵoj en la domajnoj NiRAN kaj RdRp estis respektive Uzu Ala anstataŭe (Figuro 6A kaj SI-apendico, Tabelo S2).K4465 en SARS-CoV-2 nsp12 respondas al K4135 en HCoV-229E (SI-Apendico, Figuro S2), kiu pruvis esti postulata por NiRAN-agado kaj HCoV-229E-reproduktado (Figuro 3D kaj E).Tiu restaĵo ankaŭ egalrilatas al la arteria viruso EAV nsp9 K94-restaĵo, kiu antaŭe pruviĝis esti necesa por NiRAN mem-UMPylation/mem-GMPylation (16).Kiel montrite en Figuro 6B, SARS-CoV-2 nsp12 havas UMP-transferazan agadon uzante nsp9 kiel substraton, dum la nsp12_K4465A-aktiva retejo-mutaciulo estas neaktiva.La duobla anstataŭigo en la SDD-karakteriza sekvenco de RdRp-motivo C ne influas UMP-transferaz-agadon (Figuro 6B), indikante, ke RdRp-agado havas neniun rektan efikon en nsp9-UMPylation.Similaj datumoj estis akiritaj per CTP, GTP kaj ATP (SI-apendico, Figuro S10).Resume, ĉi tiuj datumoj indikas, ke NMPylation perita de NiRAN-nsp9 havas konservativan agadon en koronavirusoj reprezentantaj malsamajn genrojn de la subfamilio de ortokoronavirusoj.
SARS-CoV-2 nsp12-mediata NMPylation de nsp9.(A) Coomassie makulis SDS-poliakrilamida ĝelo montrante la rekombinan proteinon uzitan en la NMPylation-testo.Kiel kontrolo, mutaciulo-proteino kun aktiva eja anstataŭigo en la domajno NiRAN (K4465A) kaj RdRp (DD5152/3AA) de SARS-CoV-2 nsp12 estis uzata.Restnumerado baziĝas sur pozicio en pp1ab.(B) Aŭtorradiografo de UMPylation-detekto uzante nsp9-His6 kaj [α-32P]UTP kiel la substraton de nsp12-His6 (sovaĝa tipo [wt] kaj mutaciulo).La molekula maso (en kilodaltonoj) de la etikedita proteino estas montrita maldekstre.
NiRAN-domajnoj estas ĝenerale konservitaj en Nidovirales (16), indikante ke ili katalizas enzimatajn reagojn esencajn por Nidovirus-reproduktado.En ĉi tiu studo, ni povis pruvi, ke la NiRAN-domajno de la koronavirus transdonas NMP (generitan de NTP) al nsp9, misteran RNA-ligan proteinon implikitan en virusreproduktado (26 ?? 29 ), por determini ĝin kiel natura celo kaj partnero de koronavirus RTC.
La NiRAN-domajno dividas tri sekvencmotivojn (AN, BN, kaj CN), kiuj enhavas tre malgrandan nombron da restaĵoj kiuj estas konservitaj en ĉiuj familioj en la monofiletika sed tre diferencigita Nidovirales-ordo (8, 16).Lastatempaj studoj montris ke ili estas strukture rilataj al plejparte nekarakterizita familio de proteinkinaz-similaj proteinoj, kiuj estis origine nomitaj la SelO-familio (17, 19, 22, 30, 31).SelO-rilataj proteinoj havas kinazfaldojn, sed malhavas plurajn konservitajn aktivajn restaĵojn en klasikaj kinazoj (22, 32).Surbaze de la inversa orientiĝo de ATP-molekuloj ligitaj al la aktiva loko kaj stabiligitaj per specifaj interagoj, SelO estis hipotezita kaj poste konfirmita transdoni AMP (anstataŭ fosfato) al la proteinsubstrato (22), dum alia bakteria SelO-simila proteino YdiU havas lastatempe pruviĝis katalizi la kovalentan ligon de UMP al Tyr kaj His-restaĵoj de malsamaj proteinsubstratoj (33).
Por konfirmi kaj vastigi la antaŭdiron de la supozataj aktivaj restaĵoj de la koronavirus-NiRAN-domajno, ni uzis biokemiajn kaj inversajn genetikajn metodojn por fari mutacianalizon sur la koronavirus nsp12 (Figuro 3D kaj E kaj SI-apendico, Figuro S3 kaj tablo) S1â S4).La datumoj montras, ke la anstataŭigo de HCoV-229E K4135, R4178 kaj D4280 kun Ala forigas en vitro NMP-transferaz-agadon kaj virusreproduktadon en ĉelkulturo (Figuro 3D kaj E kaj SI-apendicoj, Figuro S3), subtenante ilian ĉeeston en NTP-γ-fosfato. (K4135, R4178) kaj la kunordigo de aktivaj metalaj jonoj (D4280).La E4145A-anstataŭigo de la konservita Glu en la intervalo de la birda nestoviruso antaŭdirita stabiligi la pozicion de K4135 (17) pruviĝis elimini virusreproduktadon, sed surprize, la agado estis retenita en la in vitro NMPylation-analizo (Figuro 3D kaj E kaj SI-apendico, Figuro S3 Kaj Tabeloj S1–S4).Simila observado estis farita kiam la responda anstataŭigo estis enkondukita en la YdiU homologo de Salmonella typhimurium (E130A) (33).Kunigitaj, tiuj datumoj apogas la reguligan funkcion de tiu konservita restaĵo prefere ol la kataliza funkcio.
Anstataŭigi la konservitan Phe-restaĵon (F4281A) ene de la intervalo de nestoviruso en la HCoV-229E NiRAN-domajno (8) rezultigis malkreskon en NMPylation-agado en vitro kaj signifa malkresko en virusreproduktado en ĉelkulturo (Figuro 3D, E kaj SI) apendico, Figuro S3).La datumoj kongruas kun la grava reguliga funkcio de ĉi tiu restaĵo, kiel la homologa DFG-ĉefaĵo Phe-restaĵo montrita antaŭe.En klasikaj proteinkinazoj, ĝi estas parto de la Mg2+-liga buklo kaj helpas kunmeti kaj reguligi la spinon???Bezonata por efika kataliza agado (32, 34).Anstataŭigi Ala kaj Arg por K4116-restaĵoj (en la preAN-motivo), respektive, eliminis virusreproduktadon kaj, kiel atendite, havis malsamajn efikojn al NMP-transferaza agado en vitro, depende de la aminoacida flanka ĉeno enkondukita (Figuro 3D Kaj E kaj SI apendicoj). , Figuro S3).La funkciaj datumoj kongruas kun la strukturaj informoj, indikante, ke ĉi tiu restaĵo establis interagon kun ATP-fosfato (17).En la NiRAN-domajno de aliaj nestitaj virusfamilioj, la pozicio de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 estas okupata de Lys, Arg aŭ His (8), indikante ke la funkcia limigo de ĉi tiu specifa restaĵo estis malstreĉita.La anstataŭigo de D4188A kaj D4283A forigas aŭ forte reduktas enziman aktivecon kaj forigas virusreplikadon (Figuro 3).Tiuj du restaĵoj estas konservitaj en la plej multaj (sed ne ĉiuj) nestitaj virusoj (8), indikante gravan famili-specifan sed eble ne-katalizan funkcion.Ala-anstataŭiĝoj de pluraj aliaj Lys kaj Asp-restaĵoj (K4113A, D4180A, D4197A kaj D4273A) kiuj ne estas konservitaj en la Coronaviridae aŭ aliaj Nestioviridae familioj (8) estis utiligitaj kiel kontroloj.Kiel atendite, ĉi tiuj anstataŭoj estas plejparte tolereblaj, kun eta malkresko en enzima aktiveco kaj virusreproduktado en iuj kazoj (Figuro 3 kaj SI-apendico, Figuro S3).Ĝenerale, la koronavirus-mutagenezaj datumoj estas tre kongruaj kun la mem-GMP kaj inversa genetika datumoj de EAV NiRAN-RdRp (16), en kiuj EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) restaĵo K94 (korespondanta al HCoV-229E K4135) gravaj funkcioj), R124 (korespondanta al R4178), D132 (korespondanta al D4188), D165 (korespondanta al D4280), F166 (korespondanta al F4281).Krome, la datumoj de mutagenezo de HCoV-229E estas kongruaj kun kaj disetenditaj de la antaŭe raportitaj datumoj de inversa genetiko de SARS-CoV (16), same tre similaj al tiuj observitaj por la responda CN-motivo Phe-al-Ala mutaciulo SARS-CoV_nsp12 La fenotipo priskribita -F219A kaj HCoV-229E_F4281A (Figuro 3 D kaj E kaj SI apendico, Figuro S3 kaj Tabelo S1-S4).
Kompare kun EAV-ortologoj (16), kiuj havas klaran preferon por UTP kaj GTP (en la mem-NMPylation-reago), nia studo montras, ke la koronavirusa NiRAN-domajno (reprezentita de HCoV-229E kaj SARS-CoV-2) povas esti efike. translokigitaj Ĉiuj kvar NMP-oj, kvankam estas iometa prefero por UMP (Figures 1 kaj 3).La relative malalta specifeco de la specifa NTP-kunsubstrato kongruas kun la lastatempe raportita SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13-superkunmetita strukturo, en kiu ADP-Mg2+ ligas al la aktiva loko de NiRAN, sed ne kun adenina Parto. de la formado de specifaj interagoj (17).En nia studo, la speco de nukleotido uzata en la reago de NMPylation ne havas diferencigan efikon sur la agado de la mutacianta proteino (SI-Apendico, Figuro S3), indikante, ke neniu el ĉi tiuj restaĵoj estas proksime rilataj al la ligado de specifa nukleobazo.La struktura bazo kaj ebla biologia signifo de la malsamaj NTP-ko-substrataj preferoj observitaj en la NiRAN-domajnoj de koronavirusoj kaj arteriaj virusoj restas por studi;ili povas esti veraj aŭ povas esti pro la limigoj de siaj respektivaj studoj.Nuntempe, oni ne povas ekskludi, ke la ebla NMPylator-agado de la arteria virusa domajno NiRAN (kompare kun la antaŭe karakterizita mem-NMPylation-agado) havas malsaman kunsubstratan preferon, konsiderante, ke la simileco inter la arteria kaj la koronavirus. NiRAN-domajno estas ĉe sia limo.Sekvenc-bazita Komparu (16).Kompare kun la pseŭdokinazo SelO, kiu uzas Mg2+ kiel kofaktoron, la agado de koronavirus kaj arteria viruso NiRAN dependas de Mn2+ (16) (Figuro 3C kaj SI-apendico, Figuro S1).La Mn2+-dependeco kaj evidenta prefero por UTP estas nekutima trajto de proteinaj NMPylators, kaj nur lastatempe estis konfirmitaj en la YdiU-proteino de Salmonella typhimurium, kiu katalizas la striktan Mn2+-dependan proteinŝaperonon UMPylation por protekti ĉelojn kontraŭ stresindukto Ĉela ATP-naĝejo ( 33).
La lastatempe priskribita struktura simileco inter la koronavirusa NiRAN-domajno kaj ĉelaj proteinkinazoj (17, 19) provizas plian subtenon por la kapablo de NiRAN kovalente ligi NMP al aliaj proteinoj, kiujn ni raportis en ĉi tiu studo.Ni enfokusigis nian serĉon por eblaj NiRAN-celoj sur la proteinoj koditaj de HCoV-229E ORF1a, kiuj povas rekte aŭ nerekte helpi la ORF1b-kodigitan kopiazon de RTC (12, 35).Niaj eksperimentoj provizas konkludan indicon por la efika kaj specifa NMPylation de nsp9 (Figuro 2).Se la celproteino estas uzata en molara troo, kiu estas 8 ĝis 10 fojojn pli alta ol tiu de la enzimo (nsp12), estas konfirmite, ke nsp9 estas tute (mono)NMPigita (Figuro 4).Ni konkludis, ke la interago inter nsp12 kaj nsp9 estas mallongdaŭra kaj ne formos stabilan komplekson kun nsp9 (en foresto de aliaj RTC-subunuoj).Ĉi tiu konkludo estas subtenata de proteinaj interagaj studoj pri la proteomo SARS-CoV (35).MS-analizo identigis la primaran aminon de la N-fina restaĵo de nsp9 kiel la NMPylation-ejo (SI-apendico, Figuro S5).La formado de la fosforamidatligo kaj la N-fina aminogrupo distingas la NiRAN-mediaciitan NMPylation-agadon de la Pseudomonas syringae SelO-mediata AMPylation-reago, kiu katalizas la formadon de O-ligita AMP ĉe Ser, Thr, aŭ Tyr-restaĵoj Peptide-adukto ( 22), kaj S. typhimurium YdiU formas O-ligitajn (kun Tyr) kaj N-ligitajn (kun His) peptid-UMP-aduktojn.La limigitaj informoj haveblaj pri la SelO-familio de proteinoj indikas ke membroj de tiu granda proteinfamilio malsamas multe en la formado de peptid-NMP-aduktoj.Ĉi tio estas interesa observo, kiu meritas plian studon.
La datumoj akiritaj en ĉi tiu studo igis nin hipotezi, ke la NMPylation de nsp9 postulas liberan N-finaĵon.En la kunteksto de virusreproduktado, tio estos disponigita per la proteoliza fendetaĵo de la nsp8|nsp9 pretigejo en la replikaza poliproteino pp1a mediaciita fare de Mpro kaj pp1ab.En la plej multaj koronavirusoj, la diferenco inter ĉi tiu specifa retejo (VKLQ|NNEI en HCoV-229E) kaj ĉiuj aliaj koronavirusaj Mpro-fendejoj estas Asn (prefere ol alia malgranda restaĵo, kiel Ala, Ser Aŭ Gly) okupas P1â???Loko (36).La peptidaj fenditaj datumoj akiritaj en la fruaj studoj montris, ke la fendiĝa efikeco de la nsp8|nsp9-ejo estis pli malalta ol tiu de aliaj ejoj, indikante, ke 1) ĉi tiu specifa ejo povas havi reguligan rolon en la ĝustatempe kunordigita pretigo de la C-finaĵo. pp1a regiono, aŭ 2) a La rolo de la speciala konservita nsp9 N-finaĵo en virusreproduktado (37).Niaj datumoj (Figuro 5A) montris, ke la rekombina formo de nsp9 portanta la realan N-finan sekvencon estis efike NMPigita de nsp12.La N-fina flanka sekvenco estis forigita de faktoro Xa (nsp9-His6; SI-apendico, Tabelo S1) aŭ Mpro-mediata fendiĝo (nsp7-11-His6; Figuro 5A kaj SI-apendico, Tabelo S1).Grave, la netranĉita nsp9-entenanta antaŭulo nsp7-11-His6 montris reziston al NMPylation de nsp12, kiu kongruas kun niaj datumoj, indikante, ke la nsp9-NMP-adukto estas formita per la N-fina primara amino (SI-apendico, Figuro S5) .Por akiri pli profundan komprenon de NiRAN-substratospecifo, ni tiam temigis la apudajn N-finajn restaĵojn de nsp9.En la foresto de aliaj proteinoj, ili estas strukture flekseblaj, malhelpante ilin esti detektitaj en la neetikedita formo de nsp9 (26 28, 38), indikante ilian limigitan naturan varion. Tio estas pro la grava sekvenc-specifa (ne sekundara strukturo rilata) funkcio de la nsp9 N-fina fragmento.Ala-anstataŭiĝoj de konservitaj restaĵoj en ĉi tiu regiono (Figuroj 5C kaj D kaj SI-apendico, Figuro S8) rivelas ke N3826 estas esenca por nsp9 NMPylation in vitro, dum N3825A kaj E3827A-anstataŭiĝoj kondukas al malkresko en NMPylation, dum M3829A kaj P3830A-anstataŭiĝoj ne faras. .Evidente influas nsp9 NMPylation.Kvankam la anstataŭigo de N-fina Asn (N3825A, N3825S) havas nur moderan efikon al nsp9 NMPylation kaj virusreproduktado en ĉelkulturo (Figuro 5C kaj D), la forigo de Asn-restaĵosekvenco de la N-fina 3825-NN-dipeptido. pruvita esti Ĝi estas mortiga al virusoj, indikante ke unu Asn-restaĵo estas postulata antaŭ alia restaĵo ĉe la N-finaĵo, prefere Asn, kvankam ŝajnas ke anstataŭigo de similaj restaĵoj povas esti parte tolerita (Figuro 5B, C, kaj D).Ni konkludas, ke la 3825-NN-dipeptido, precipe la konservita kaj esenca N3826-restaĵo ene de la koronavirus-intervalo (SI-apendico, Figuro S6), certigas la ĝustan ligon kaj orientiĝon de la nsp9 N-finaĵo en la aktiva loko de NiRAN.
Anstataŭigi Ala (E3827A) por la konservita Glu de ĉiuj subfamilioj retenas nsp9 NMPylation in vitro sed estas mortiga al virusoj en ĉelkulturo (Figuro 5C kaj D), indikante la kroman funkcion de ĉi tiu restaĵo, ekzemple, en ŝlosilaj interagoj (NMPilated aŭ nemodifita). ) nsp9 N-finstacio kaj aliaj faktoroj implikitaj en virusreproduktado.Nsp9-mutacioj ne influis la proteolizan procezon de nsp9 aŭ ajnan apudan nsps (39) (SI-Apendico, Figuro S9), indikante ke la mortigaj fenotipoj de pluraj nsp9-mutacioj observitaj ne estis kaŭzitaj de la misreguligo de la C proteolita procez-fina pp1a areo. .
Ĉi-supraj datenoj disponigas indicon ke post Mpro-mediaciita traktado de la nsp8|9 fendloko en pp1a/pp1ab, la N-finaĵo de nsp9 povas esti UMPilated (aŭ parte modifita kun alia NMP).Krome, la bonega konservado de la N-finaĵo de nsp9 (inkluzive de la unuopaj kaj senvariaj Asn-restaĵoj en la koronavirus-familio) kaj la inversaj genetikaj datumoj akiritaj en ĉi tiu studo (Figuroj 3E kaj 5D) igis nin konkludi, ke la priskribita nsp9 NMPylation. estas biologie rilata kaj esenca por reproduktado de koronavirusoj.La funkciaj sekvoj de ĉi tiu modifo restas studindaj, ekzemple, koncerne la antaŭe priskribitan (nespecifan) nsp9 (nemodifita formo) RNA-liga agado (2628).N-fina NMPylation ankaŭ povas influi la interagadon de nsp9 kun proteino aŭ RNA-substratoj aŭ la formadon de malsamaj kvar-nivelaj asembleoj.Ĉi tiuj estis observitaj en strukturaj studoj kaj estis konfirmitaj funkcie rilataj al koronavirus-reproduktado, kvankam precipe en la foresto de En la kazo de ĉi tiu modifo (26-ââ29, 40).
Kvankam la cela specifeco de la koronavirusa NiRAN-domajno ankoraŭ devas esti pli detale karakterizita, niaj datumoj montras, ke la proteina celspecifo de la koronavirusa NiRAN-domajno estas tre mallarĝa.Kvankam la konservado de ŝlosilaj aktivaj ejrestaĵoj (8, 16) en la NiRAN-domajno de ĉiuj nidovirusfamilioj forte subtenas la agadon de la konservita NMPylator ĉi tiuj proteinoj, la identeco de la substrato ligantaj poŝrestaĵoj de ĉi tiu domajno Konservado kaj konservado restas karakterizenda. , kaj povas malsami inter malsamaj familioj de Nidovirales-celoj.Simile, la koncernaj celoj de aliaj nestitaj virusoj ankoraŭ devas esti determinitaj.Ili povas esti malproksimaj ortologoj de nsp9 aŭ aliaj proteinoj, ĉar la sekvencoj ekster la kvin replikazaj domajnoj kiuj estas ĝenerale konservitaj en nestitaj virusoj estas malpli konservitaj (8), inkluzive de la genararo inter Mpro kaj NiRAN, Inter ili, nsp9 situas en la kronviruso.
Krome, ni ne povas nuntempe ekskludi la eblecon ke la NiRAN-domajno havas pliajn (inkluzive de ĉelaj) celojn.En ĉi tiu kazo, indas mencii, ke la bakteriaj homologoj en ĉi tiu emerĝanta proteino NMPylators (NMPylators) (30, 31) ŝajnas havi "majstrajn reguligantojn"?NMP modulas diversajn ĉelajn proteinojn por reguligi aŭ forigi iliajn kontraŭfluajn agadojn, tiel ludante rolon en diversaj biologiaj procezoj, kiel ekzemple ĉela streĉa respondo kaj redox-homeostazo (22, 33).
En ĉi tiu studo (Figuroj 2 kaj 4 kaj SI Apendico, Figuroj S3 kaj S5), ni povis pruvi, ke nsp12 transdonis la UMP (NMP) parton al ununura (konservita) pozicio en nsp9, dum aliaj proteinoj ne estis modifitaj en la uzata Sub la kondiĉoj, bone difinita (prefere ol loza) substratspecifeco estas subtenata.Konsekvence kun tio, kompare kun N-fina nsp9 NMPylation, la propra NMPylation-agado de nsp12 estas tre malalta, ĝia detekto postulas pli longan aŭtoradiografian ekspontempon, kaj 10-obla pliiĝo en nsp12-koncentriĝo estas uzata.Krome, nia MS-analizo ne provizis pruvojn pri NMPylation de nsp12, kio sugestas, ke NiRAN-domajna mem-NMPylation estas (en la plej bona kazo) sekundara agado.Tamen, oni devas rimarki, ke aliaj studoj provizis antaŭajn pruvojn, ke la mem-AMPylation statuso de bakteria NMPylator povas kontroli sian NMPylation-agadon sur aliaj proteinsubstratoj (22, 33).Tial, pli da esplorado estas necesa por esplori la eblajn funkciajn efikojn de mem-NMPylation-agadoj raportitaj por EAV nsp9 (16) kaj koronavirus nsp12 (ĉi tiu studo), inkluzive de la proponita ŝapero-simila efiko al la faldado de la C-fina RdRp-domajno ( 16)).
Antaŭe, pluraj hipotezoj koncerne la eblajn kontraŭfluajn funkciojn de la nidovirusa NiRAN-domajno estis pripensitaj, inkluzive de RNA-ligazo, RNA-kapa guanilattransferazo kaj proteina agado (16), sed neniu el ili estas kongrua kun la haveblaj kontraŭfluaj funkcioj.La informoj akiritaj en la sekvaj pozicioj estas ĝuste la sama tempo sen fari pliajn supozojn.La datumoj akiritaj en ĉi tiu studo estas plej kongruaj kun (sed ne povas pruvi) ke la NiRAN-domajno estas implikita en la iniciato de protein-induktita RNA-sintezo.Antaŭe oni kredis, ke la funkcio de la domajno NiRAN en 5??²-RNA-kaptado aŭ RNA-ligaj reagoj ne estas tuŝitaj de ĉi tiuj kaj Subteno de aliaj datumoj.Tial, ekzemple, la aktiva loko de NiRAN estas konsiderita impliki la konservitan Asp kiel ĝenerala bazo (D252 en Pseudomonas syringae SelO; D4271 en HCoV-229E pp1ab; D208 en SARS-CoV-2 nsp12) (SI Apendico, figuro 2) ).S2) (17, 22, 33), dum la katalizo en la ATP-dependa RNA-ligazo kaj RNA-kapa enzimo estas farita per la kovalenta enzimo-(lisil-N)-NMP-intermedio, kiu implikas ne-Ŝanĝitan Lys-restaĵon ( 41).Krome, la rimarkinda sekvenc-bazita specifeco de la koronavirus NiRAN por konservitaj proteinceloj kaj la malstreĉita specifeco por NTP-ko-substratoj (preferas UTP) kontraŭbatalas NiRAN-mediaciitan kampan enzimon aŭ RNA-ligaz-similajn funkciojn.
Evidente, necesas multe da ekstra laboro por kontroli kaj, se pruvite, pliprofundigi la ebla rolo de nsp9-UMP (nsp9-NMP) en protein-induktita RNA-sintezo, kiu kunligos plurajn interesajn sed (ĝis nun) raportojn antaŭe raportitajn. .Izolitaj observoj.Ekzemple, estis determinite, ke la fino de la negativa-fadena RNA de koronavirus komenciĝas per oligo(U) fadeno (42, 43).Tiu observado estas kongrua kun la ideo ke la sintezo de negativa-fadena RNA estas iniciatita ligante la UMPilated-formon de nsp9 al la poli(A) vosto ( ellasiloj), kiu povas esti antaŭenigita per sia RNA-ligado La agado kaj/aŭ interagado kun alia RTC-proteino.La UMP-parto disponigita per nsp9 tiam povas esti utiligita kiel "primo" por nsp7/8/nsp12-mediaciita oligouridilation, uzante la 3??²-poli(A) voston en la genoma RNA aŭ Alia oligo (A)-enhava sekvenco funkcias kiel ŝablono, simila al la mekanismo establita por la picornavirus VPg proteino (44).Kio se la propono estas "nenormativa"????La komenco de la (protein-induktita) negativa-fadena RNA-sintezo disponigas ligon al la observaĵoj, indikante ke la koronavirus-negativa-fadena RNA havas UMP (anstataŭ UTP) ĉe sia fino (42), kio estas konsiderata indikanta ke la nuklea acido Dicer fendas la finon fosforilate de nekonata uridin-specifa endonukleazo.Se konfirmite, ĉi tiu hidroliza agado de nuklea acido povas helpi liberigi la oligomeran UMPilitan formon de nsp9 de la 5 ² fino de la naskiĝanta negativa fadeno.La ebla rolo de nsp9 en proteinpretigo ankaŭ kongruas kun antaŭaj inversaj genetikaj studoj, kiuj montris, ke nsp9 (kaj nsp8) interagas kritike kaj specife kun la konservita cis-aganta RNA-elemento proksime de la 3-a fino de la koronavirus-genaro.45).Laŭ ĉi tiu raporto, ĉi tiuj antaŭaj observoj nun povas esti reekzamenitaj kaj vastigitaj per plia esplorado.
Resume, niaj datumoj determinis la specifan agadon de proprieta nestita virusa enzimetikedo ligita al RdRp ĉe la N-finstacio.En koronavirus, ĉi tiu lastatempe malkovrita NiRAN-mediaciita UMPylator/NMPylator-agado estas uzata por fidi Mn2+ kaj apudaj Asn-restaĵoj kaj kaŭzi la formadon de (malaltenergiaj) fosforamidataj ligoj kun la N-fina primara amino.Tra Mpro-mediaciita intermama fendo ĉe la nsp8|9 fendloko, la nsp9-celo povas esti uzita por NMPylation, indikante la funkcian kupladon inter la proteazo kaj la NiRAN-domajno, kiu etendiĝas al RdRp.La konservado de ŝlosilaj restaĵoj en la aktiva ejo nsp12 NiRAN kaj la celo nsp9, kombinita kun datumoj akiritaj de du koronavirusoj inkluzive de SARS-CoV-2, provizas fortan indicon, ke nsp9 NMPylation estas koronavirus Konservativaj trajtoj ankaŭ estas ŝlosila paŝo en virusreproduktado.La disponeblaj datumoj igas nin konkludi, ke la specifa rolo de NMPiligita formo de nsp9 en protein-induktita RNA-sintezo estas akceptebla scenaro por koronavirus kaj aliaj nestitaj virusoj, kaj NiRAN ankaŭ povas celi aliajn neidentigitajn proteinojn.Reguli la viruson.Gastiga interago.Se konfirmite, la implikiĝo de proteinaj enkondukoj en virusa RNA-sintezo pliigos la sekvenc-afinecon de la domajnoj Mpro/3CLpro kaj RdRp inter la antaŭe detektita koronavirus kaj pikornavirus-simila supergrupo (9), kiuj nun estis unuigitaj en la lastatempe establitaj Pisoniviritoj ( 46) en la kategorio.
Niaj datumoj ankaŭ montras, ke la bazaj, selektemaj kaj konservativaj enzimaj agadoj identigitaj en ĉi tiu studo povas esti uzataj kiel celoj por kontraŭvirusaj drogoj.Kunmetaĵoj kiuj malhelpas la ligadon (kaj postan modifon) de la konservita nsp9 N-finaĵo en la aktiva loko de NiRAN povas esti evoluigitaj en efikajn kaj multfacetajn kontraŭvirusajn medikamentojn, taŭgajn por la terapio de bestoj kaj homaj koronavirusoj de malsamaj (sub)genraj Infektoj. , inkluzive de SARS-CoV-2 kaj Mezorienta Spira Sindromo Coronavirus.
La koda sekvenco de la koronavirus-proteino produktita en ĉi tiu studo estis plifortigita per RT-PCR uzante RNA izolita de Huh-7 infektita kun HCoV-229E aŭ Vero E6 infektita kun SARS-CoV-2, kaj enigita per normaj klonaj proceduroj.pMAL-c2 (Nov-Anglia Biologia Laboratorio) aŭ pASK3-Ub-CHis6 (47) esprimvektoro (SI-Apendico, Tabloj S1 kaj S2).Unuopaj kodonanstataŭaĵoj estis lanĉitaj per PCR-bazita ejo-direktita mutagenezo (48).Por produkti la MBP-fuzioproteinon, E. coli TB1-ĉeloj estis transformitaj kun la taŭga pMAL-c2-plasmidkonstruaĵo (SI-apendico, Tabelo S1).La fuzioproteino estis purigita per amiloza afineckromatografio kaj fendita kun faktoro Xa.Poste, la C-fina His6-etikedita proteino estis purigita per Ni-senmovigita metala afinec-kromatografio (Ni-IMAC) kiel antaŭe priskribite (49).Por produkti la ubiquitin-fuzioproteinon, E. coli TB1-ĉeloj uzis la konvenan pASK3-Ub-CHis6-plasmidkonstruaĵon (SI-Apendico, Tabloj S1 kaj S2) kaj pCGI-plasmidan DNA kodantan ubiquitin-specifan C-finan hidrolazon 1 (Ubp1).Transformo (47).La C-finaĵo His6-etikedita koronavirusproteino estis purigita kiel antaŭe priskribite (50).
La mem-NMPylation-testo de HCoV-229E nsp12-His6 estis farita kiel priskribite en EAV nsp9 (16).Mallonge, nsp12-His6 (0.5 µM) enhavas 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonan acidon (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM ditiotreitolo (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM bufro, kovi la precizigita NTP kaj 0.17 µM egalis [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) je 30 °C dum 30 minutoj.En ĉiuj aliaj (normaj) NMPylation-analizoj de nsp12-mediata nsp9 NMPylation, la reagkondiĉoj estas alĝustigitaj jene: nsp12-His6 (0.05 µM) kaj nsp9-His6 (4 µM) en ĉeesto de 50 mM HEPES-KOH (pH 80. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM indikis NTP, kaj 0.17 µM egalis [α32-P] NTP.Post kovado dum 10 minutoj je 30 °C, la reakcprovaĵo estis miksita kun SDS-PAGE specimena bufro: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometano HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerolo kaj 0,005% bromofenolo blua.La proteino estis denaturigita per varmigado je 90 °C dum 5 minutoj kaj apartigita je 12% SDS-PAGE.La ĝelo estas fiksita kaj makulita kun Coomassie Brilliant Blue-solvo (40% metanolo, 10% acetacido, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), senkolorigita, kaj eksponita al fosforeska bildiga ekrano dum 20 horoj (por detekti nsp12 de NMPylation) aŭ (maksimume) 2 Horoj (por taksi nsp9 NMPylation).Typhoon 9200 bildilo (GE Healthcare) estis uzita por skani la ekranon kaj ImageJ estis uzita por analizi la signalintensecon.
Por MS-analizo, 1 µM nsp12-His6 kaj 10 µM nsp9 (sen hexahistidine-etikedo) estis uzitaj en NMPylation-analizo (SI-apendico, Tabelo S1) kaj la pliigita koncentriĝo de 500 µM UTP kaj GTP estis uzataj.Depende de ilia koncentriĝo kaj atendata proteinkvalito, Waters ACQUITY H-Class HPLC-sistemo ekipita per MassPrep-kolumno (Akvoj) estis uzita por sensaligi 1 ĝis 10 µL da bufritaj proteinsolvoj rete.La sensaligita proteino estas eligita en la elektrospray-jonfonton de Synapt G2Si mas-spektrometro (Akvoj) tra la sekva gradiento de bufro A (akvo/0,05% formitacido) kaj bufro B (acetonitrilo/0,045% formitacido), kaj la kolumna temperaturo estas 60 ° C kaj flukvanto de 0,1 mL/min: eluo izokrate kun 5% A dum 2 minutoj, tiam lineara gradiento al 95% B ene de 8 minutoj, kaj konservu 95% B dum aliaj 4 minutoj.
Pozitivaj jonoj kun amasintervalo de 500 ĝis 5000 m/z estas detektitaj.Glu-fibrinopeptido B estas mezurita ĉiujn 45 sekundojn por aŭtomata korekto de amasa drivo.Uzu MassLynx-instrumentan programon kun MaxEnt1-etendo por malkonvolvi la mezan spektron post deduktado de la bazlinio kaj glatiĝo.
UMPylated HCoV-229E nsp9 estis digestita aldonante sekvenc-gradan modifitan tripsinon (Serva) kaj kovita dum la nokto je 37 °C.Kromabond C18WP spinkolono (partnumero 730522; Macherey-Nagel) kutimis sensaligi kaj koncentri la peptidojn.Finfine, la peptido estis solvita en 25 µL da akvo, kiu enhavis 5% acetonitrilon kaj 0.1% formikacidon.
La specimenoj estis analizitaj de MS uzante mas-spektrometron Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).La finfina nanoâ HPLC-sistemo (Dionex), ekipita per kutimo fin-muntita 50 cm??75 μm C18 RP-kolumno pakita kun 2.4 μm magnetaj bidoj (D-ro. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Konekti al la mas-spektrometro interrete tra la Proxeon nanospray-fonto;injektu 6 µL da tripsina digesta solvaĵo en internan diametron de 300 µm ×??1 cm C18 PepMap antaŭkoncentra kolono (Thermo Scientific).Uzante akvon/0.05% formicacidon kiel la solvilon, la provaĵo estis aŭtomate kaptita kaj sensaligita kun flukvanto de 6 µL/min.
La sekvaj gradientoj de akvo/0,05% formitacido (solvento A) kaj 80% acetonitrilo/0,045% formitacido (solvento B) estis uzataj por atingi la apartigon de triptaj peptidoj kun flukvanto de 300 nL/min: 4% B por 5 minutoj, tiam 30 A lineara gradiento al 45% B ene de minutoj, kaj lineara pliiĝo al 95% solventa B ene de 5 minutoj.Konektu la kromatografian kolumnon al neoksidebla ŝtala nano-emitoro (Proxeon), kaj ŝprucigu la eluivon rekte al la varmigita kapilaro de la mas-spektrometro uzante potencialon de 2,300 V. La enketa skanado kun rezolucio de 60,000 en la masanalizilo Orbitrap estas asociita. kun almenaŭ tri datumoj MS/MS skanadoj, dinamike ekskluditaj dum 30 sekundoj, uzante linearan jonkaptilon kolizio induktita disociado aŭ pli alta energia kolizio disociado kombinita kun orbitrap detekto , La rezolucio estas 7,500.
Afiŝtempo: Aŭg-03-2021